核酸抽提中的样品的裂解和纯化方法,原理和注

2020-07-18 12:42 admin
核酸抽提经验及原理 1:核酸抽提原理 简单地讲,核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分,如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。 经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用,除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris),还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl)等。去污剂则是通过使蛋白质变性,破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶;利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的,该方法已经成为了 RNA 抽提的主流,却不是基因组 DNA 抽提的主流。 最常用的纯化方法,一是PC 抽提 + 醇沉淀,二是介质纯化。第一种方法是利用 PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质,实现核酸与蛋白质的分离;再用醇将核酸沉淀下来,实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质,在某些特定的条件下,选择性地吸附核酸,而不吸附蛋白质及盐的特点,实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体,省略了 PC操作的麻烦。当然,也有不纯化的抽提方法,但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等 -的去除,基本上都是在这两种方法的基础上,通过增加一些特别的试剂,或者增加一些额外的步骤来实现的。 2:了解你的实验样品 如果你研究某个实验样品,并且要抽提它的核酸,以下的信息一定要先行收集:该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知,当样品稍微有一点复杂时,抽提核酸的实验就会碰到许多问题。以血液为例,如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右,而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组 DNA,怎么可能成功?失败了又怎么知道原因所在?同时,只有对实验样品有所了解,才能正确选择裂解方法。 绝大部分情况下,使用新鲜样品可以获得最好的结果。对一些杂质含量高的样品,如果使用新鲜样品抽提基因组 DNA 是碰到杂质残留过大的问题,可以试一下 -20C保存一天后再抽提的对策,可能会有意想不到的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存,也要先简化一下样品:血液最好只保存有核细胞;将样品分割后保存,避免反复冻融。如果实验室不具备合适的保存条件,将样品先裂解后再保存,是一个不错的选择。 3:裂解方法的评价 含蛋白酶的裂解方法,可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小,故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用;同时,巨大的基因组 DNA是很容易“缠”住大分子的东西的,蛋白质被蛋白酶消化变小后,则不容易被基因组 DNA“缠”住,有利于蛋白质在纯化操作中的去除,使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是,如果基因组 DNA 与蛋白质“缠”在一起,在纯化的过程中有两种可能:如果基因组 DNA 的特性占优势,则纯化时以 DNA的形式被保留下来,导致蛋白质的残留;如果蛋白质的特性占优势,则纯化时以蛋白质的形式被去除,导致 DNA 的损失。有些样品,如肌肉,即使是RNA 抽提,也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质),原因在于这些样品中的蛋白质,是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。 不使用蛋白酶的去污剂裂解方法,仍然在细胞基因组 DNA抽提方面有优势,尤其是当得率和纯度要求不是最高,而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀,可以实现最简单的操作,但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。 高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法,是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提,最重要的是快速裂解细胞膜,至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题,因为都不会对以后的纯化产生大的影响,可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜,进而迅速抑制住细胞内的 RNA酶,从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物,其它绝大部分样品的 RNA的抽提,都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。该方法也可用于基因组 DNA 抽提,非常快速简单,但纯度不是很高。 含 CTAB的裂解液,几乎成为富含多糖的样品,如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。